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Incorporación de métodos ópticos cuantitativos de fase en microscopio de diseño personalizado para el monitoreo de ensayos celulares (04/2024 - a la fecha)
Proyecto de Iniciación a la Investigación
El proyecto propuesto busca expandir mitrabajo realizado durante un doctorado en el desarrollo de un microscopio personalizado. Este microscopio ha permitido trabajar con diversas muestras biológicas, como células epiteliales o de carcinoma oral, utilizando imágenes de campo claro. Sin embargo, no se podía acceder a la información de fase de los cultivos biológicos sin adaptar su diseño.
El objetivo principal del proyecto es incorporar el cálculo cuantitativo de fase al microscopio diseñado. Se tienen varios tipos de métodos para recuperar la fase de la luz que pasa a través de la muestra, destacando dos enfoques principales: interferométricos y no interferométricos.
Los métodos interferométricos implican la interferencia entre dos haces de luz para medir la fase de un objeto, siendo precisos pero complejos. Por otro lado, los métodos no interferométricos, como la ecuación de transporte de intensidad (TIE), miden las diferencias de fase entre diferentes partes del objeto, siendo más simples pero potencialmente menos precisos.
Se discuten varios métodos para resolver la TIE, incluyendo el uso de transformadas de Fourier y el aprendizaje profundo mediante redes neuronales convolucionales. Estos métodos ofrecen soluciones innovadoras y robustas para la recuperación de fase.
El proyecto también explora las aplicaciones biológicas del cálculo de fase, como la medición de la viscosidad y elasticidad celular. Se destaca la importancia de la imagen de fase cuantitativa (QPI) para estudiar cambios en la viscoelasticidad celular sin contacto invasivo, lo que es crucial para comprender procesos biológicos como la progresión del cáncer. Además, el análisis de imágenes de fase cuantitativa puede proporcionar información sobre la rigidez celular y la transición entre tejidos benignos y malignos.
En resumen, el proyecto busca mejorar un microscopio existente permitiendo el cálculo cuantitativo de fase, utilizando métodos avanzados que van desde técnicas no interferométricas hasta el aprendizaje profundo. Esto tiene importantes implicaciones en la comprensión de procesos biológicos y en aplicaciones como la investigación del cáncer y la caracterización de tejidos.
10 horas semanales
Investigación
Coordinador o Responsable
En Marcha
Equipo:
A E Silva (Responsable) , MIGUEL AROCENA , A FERNÁNDEZ , J R ALONSO / J ALONSO , J M Llaguno
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Microscopía Holográfica Digital basada en Aprendizaje Profundo consciente de la Física (03/2023 - 12/2024 )
La Microscopía Holográfica Digital (Digital Holographic Microscopy - DHM) es una técnica que permite medir la información cuantitativa del corrimiento de fase (debido a la diferencia de caminos ópticos) que experimenta la luz cuando pasa a través de especímenes biológicos transparentes tales como células vivas. Esto la convierte en una técnica particularmente útil para el estudio no invasivo de procesos dinámicos en células tumorales (sin necesidad de teñir o etiquetar). En DHM, el holograma que contiene la información del espécimen se graba digitalmente primero para luego, tradicionalmente, intentar recuperar la información de fase en forma computacional basándose en soluciones analíticas y/o en soluciones iterativas que satisfacen la ecuación de ondas. Sin embargo, estas aproximaciones representan un alto costo en tiempo así como la generación de artefactos que degradan la calidad de las imágenes recuperadas. Por otro lado, el Aprendizaje Profundo (Deep Learning - DL) ha revolucionado el campo de la microscopía óptica computacional debido a su habilidad para solucionar eficientemente problemas inversos no lineales complejos. Sin embargo, se le ha recriminado su naturaleza de ?caja negra? por llevar a veces a resultados inconsistentes con las leyes físicas. En este sentido, la aproximación de Aprendizaje Profundo consciente de la Física (Physics-aware Deep-Learning) es atractiva porque fomenta la predicción de características condicionadas por la física y reduce la naturaleza de caja negra de los algoritmos DL. La propuesta se centra en el diseño personalizado y puesta en marcha de un microscopio holográfico digital donde se incorpora el Aprendizaje Profundo como herramienta versátil y prometedora para intentar mejorar la calidad de la reconstrucción de las imágenes. También se propone guiar o asistir a los algoritmos de DL con Física, incluyendo información proveniente de los modelos y procesos físicos subyacentes a la formación de imágenes en los algoritmos a implementar. Se espera a través de este proyecto contribuir a desarrollar una nueva línea de investigación interdisciplinaria, que explora las fronteras del conocimiento en microscopía y que puede a su vez aportar a nivel del país con el desarrollo de una técnica como es la Holografía Digital, no disponible actualmente a nivel nacional, lo que permitiría realizar a futuro estudios novedosos por ejemplo en dinámica celular tumoral.
4 horas semanales
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
RRHH formados en el proyecto:
Pregrado:1
Doctorado:2
Financiación:
Comisión Sectorial de Investigación Científica, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
J R ALONSO / J ALONSO (Responsable) , FEDERICO LECUMBERRY , MIGUEL AROCENA , A FERNÁNDEZ , Juan Llaguno , A E Silva
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Microscopio dentro de incubador de células: desarrollo de un sistema compacto de enfoque automatizado para monitoreo prolongado en tiempo real con aplicación a nuevos ensayos de migración y proliferación en carcinoma oral (06/2020 - 08/2022 )
La posibilidad de monitorear células en tiempo real por largos períodos de tiempo es una herramienta clave
en muy diversas aplicaciones como el screening de nuevos fármacos o ensayos de la capacidad proliferativa
e invasiva de células tumorales. Se trata sin embargo de un proceso muy costoso que habitualmente
requiere de un microscopio con jaula de control así como de sistemas de corrección de la deriva de foco que
ocurre habitualmente durante registros largos.
El objetivo central de este proyecto es el desarrollo de una alternativa de bajo costo mediante un
microscopio compacto que pueda caber sin dificultad en un incubador de células, cuyas piezas de montaje
específicas se puedan fabricar usando tecnología de impresión 3D, cuya óptica incorpore una lente de foco
ajustable eléctricamente para realizar un enfoque completamente no mecánico según Z y controlable
externamente a partir de una computadora y que permita la evaluación de diferentes condiciones
experimentales simultáneamente, mediante la incorporación de una platina multi-pocillos móvil en el plano
XY -impresa en 3D y controlada mediante microcontroladores open source.
Este proyecto busca además implementar metodologías de cultivo celular que contribuyan a desarrollar las
aplicaciones del microscopio compacto a la biotecnología, la salud humana y animal y la investigación
biomédica. Implementaremos ensayos de proliferación -donde se evaluará en un mismo registro la acción de
múltiples fármacos- así como de migración en 3D -aprovechando la capacidad de barrido axial de nuestro
sistema óptico- usando células de carcinoma oral, un tipo de tumor agresivo y de alta prevalencia en
Uruguay.
15 horas semanales
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
RRHH formados en el proyecto:
Doctorado:1
Financiación:
Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
A E Silva , J R ALONSO / J ALONSO (Responsable) , MIGUEL AROCENA (Responsable) , A FERNÁNDEZ , FERRARI, J. A. , Juan Llaguno , BOLOGNA-MOLINA , D'Aiuto N.
Palabras clave:
Microscopía óptica
Impresión 3D
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Imaginería Óptica Computacional y Óptica Adaptiva aplicadas a la Microscopía de Fluorescencia por Lámina de Luz (04/2019 - 03/2021 )
La microscopía de fluorescencia por lámina de luz (LSFM por sus siglas en inglés) es una técnica de aplicación biológica relativamente nueva que ha ganado terreno a lo largo del tiempo dado su gran potencial para la visualización de muestras biológicas de gran espesor. En ella la visualización por planos (optical sectioning) de la muestra 3D se obtiene a partir del uso de una lámina u hoja de luz que excita selectivamente un único plano de la muestra en el plano focal de un objetivo de microscopio dispuesto ortogonal al plano de la lámina de luz. Esta técnica permite resolver estructuras en el plano z (optical sectioning) excitando sólo un plano a la vez. Como LSFM excita sólo las moléculas cercanas al plano focal implica menor fototoxicidad y mejora la calidad en la formación de imágenes de las muestras en el tiempo. Sin embargo, a medida que la luz pasa a través del espécimen biológico, las variaciones espaciales en el índice de refracción del mismo introducen aberraciones ópticas que distorsionan la imagen adquirida. Una forma considerada recientemente para corregir esas aberraciones es a través del uso de Óptica Adaptiva (AO). Finalmente, la Imaginería Óptica Computacional combina el diseño óptico de dispositivos personalizados como en este caso la incorporación de AO-LSFM con el procesamiento digital de las imágenes adquiridas.
Este procesamiento se realiza por medio de algoritmos basados en la óptica involucrada es decir se basa en modelos físicos subyacentes al set-up óptico utilizado como por ejemplo la respuesta al impulso o PSF (Point Spread Function) del sistema. En este proyecto se propone por tanto, un acercamiento fundamentalmente interdisciplinario del tema de investigación. Se buscará que investigadores y estudiantes provenientes de diferentes disciplinas trabajen en conjunto para el desarrollo de nuevas estrategias experimentales y técnicas de reconstrucción de imágenes que colaboren para una mejor interpretación y comprensión de estructuras 3D de importancia biológica obtenidas a partir de AO-LSFM.
10 horas semanales
Instituto de Física
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
Financiación:
Comisión Sectorial de Investigación Científica, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
A E Silva , J R ALONSO / J ALONSO (Responsable) , A FERNÁNDEZ , FERRARI, J. A. , MALACRIDA L. , MIGUEL AROCENA (Responsable)
Areas de conocimiento:
Ciencias Naturales y Exactas / Ciencias Físicas /
Óptica, Acústica /
Óptica Aplicada
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Desarrollo de nuevas técnicas ópticas y de procesamiento de imágenes en microscopía multifocal para el estudio de la estructura tridimensional de esferoides tumorales multicelulares. (04/2017 - 04/2019 )
Los avances en microscopía óptica son fundamentales en investigación biomédica, y entre sus
objetivos principales está poder visualizar de manera cada vez más detallada y a la vez no invasiva
regiones previamente inaccesibles de las estructuras biológicas. Los esferoides tumorales
multicelulares (MCTS) de gran tamaño (diámetros mayores a 500µm) constituyen un modelo
tridimensional (3D) in vitro que reproduce la organización espacial de los tumores in vivo, ya que
posee una zona externa más proliferativa, una zona más profunda quiescente y una región central
hipóxica, acidificada y con abundante presencia de células necróticas. La hipoxia y la acidificación de
esta región central dan lugar a procesos de selección que pueden generar células más resistentes e
invasivas, determinando de forma crucial la evolución futura del tumor. Caracterizar de manera
detallada la organización celular de las regiones profundas en MCTS es un paso indispensable para
poder modelarin vitro procesos esenciales en el desarrollo tumoral. A su vez, para esto es
fundamental visualizar con claridad la estructura 3D en MCTS íntegros de gran tamaño, en
particular su región central. Este problema plantea grandes desafíos a las técnicas microscópicas
existentes, y hace necesario el desarrollo de nuevas metodologías de adquisición y procesamiento
de imágenes. Por un lado, se propone diseñar, montar, caracterizar y poner en funcionamiento un
dispositivo óptico experimental que funcione como un microscopio modular, adaptable para
trabajar en condiciones de campo claro así como de fluorescencia. Existen dos aspectos
instrumentales fundamentales, a incorporar de forma novedosa en el dispositivo: el uso de una lente
de foco ajustable eléctricamente (ETL) de última generación y el uso de diodos emisores de luz
(LED) como fuente de iluminación (de bajo costo y mayortiempo operativo útilque las tradicionales
lámparas de mercurio). Cabe mencionar que no existen aún microscopios con ambas características
a nivel comercial. La incorporación de una ETL permite realizar un escaneo axial óptico multifocal
del espécimen de interés evitando los problemas inherentes al convencional escaneo mecánico en
la microscopía 3D.Por otro lado, el procesamiento digital de imágenes se ha convertido en parte
integral de la microscopía moderna, permitiendo la reconstrucción de imágenes con nuevas
características de interés, tales como profundidad de campo extendida, por medio de diferentes
algoritmos. Se busca desarrollar e implementar algoritmos que permitan la visualización de todo el
volumen de los MCTS y en particular su zona central. Como se trata de muestras de gran espesor
se considerarán modelos físicos de variación de la respuesta al impulso (PSF) del sistema óptico con
la profundidad. En este proyecto se propone un acercamiento fundamentalmente interdisciplinario
en el que investigadores y estudiantes provenientes de Física, Biología e Ingeniería Eléctrica
trabajen en conjunto para el desarrollo de nuevas estrategias experimentales de adquisición así como técnicas de reconstrucción de imágenes que colaboren para una mejorinterpretación y
comprensión de la estructura 3D de los MCTS.
15 horas semanales
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
Financiación:
Comisión Sectorial de Investigación Científica, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
Julia Rosa ALONSO SIRI (Responsable) , Ariel FERNÁNDEZ CASORATTI , German Miguel AROCENA SUTZ (Responsable) , Gastón Alí AYUBI ZAVALLA , Juan Matias Di Martino Bolentini , José Roberto SOTELO SILVEIRA , Mercedes Landeira Escames , José Antonio FERRARI DAMIANO , Alejandro Emanuel Silva Miraballes
Palabras clave:
Microscopía 3D Procesamiento de Imágenes Esferoides Tumorales
Areas de conocimiento:
Ciencias Naturales y Exactas / Ciencias Físicas /
Óptica, Acústica /