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Caracterización funcional y estructural de la lactonasa clave para la biosíntesis de urolitinas a nivel de la microbiota intestinal (03/2025 - a la fecha)
proyecto: Las urolitinas son un grupo de compuestos polifenólicos que se generan en el tracto gastrointestinal gracias a la acción metabólica de las bacterias presentes en la microbiota intestinal, a punto de partida de la ingesta de alimentos ricos en ácido elágico y sus derivados. Estos compuestos han demostrado un rol positivo en los procesos de mitofagia, recambio mitocondrial y mejora de la bioenergética celular a nivel del músculo esquelético. Además, presentan un gran potencial en la prevención y tratamiento de enfermedades crónicas, como enfermedades cardiovasculares, cáncer y la enfermedad inflamatoria intestinal. El conocimiento de las bases moleculares de la metabolización del ácido elágico a nivel intestinal es crucial para poder comprender mejor los procesos implicados en la síntesis de urolitinas y desarrollar estrategias más efectivas para aumentar su disponibilidad en el organismo. Se sabe que la metabolización del ácido elágico a urolitinas implica una serie de reacciones bioquímicas que involucran diferentes enzimas presentes en distintas bacterias de la microbiota intestinal. Se ha propuesto que el primer paso, clave para éxito de la síntesis, sería catalizado por una lactonasa de la bacteria Gordonibacter urolithinfaciens, aunque esto no ha sido confirmado in vitro o in vivo.
En este proyecto buscaremos caracterizar in vitro e in silico el comportamiento de esta lactonasa, sus propiedades enzimáticas, el producto que efectivamente genera, y las bases moleculares que determinan la especificidad por su sustrato, el ácido elágico. Para conseguir estos objetivos, se integrarán técnicas biofísicas y bioquímicas experimentales con técnicas de simulación computacional, de forma de dar un sustento estructural a las propiedades observadas en la mesada. Esperamos que el conocimiento generado en este proyecto pueda tener un impacto significativo en el entendimiento de la síntesis de urolitinas y sea el puntapié para el desarrollo de estrategias sencillas y económicas para su producción.
12 horas semanales
Investigación
Coordinador o Responsable
En Marcha
RRHH formados en el proyecto:
Maestría/Magister:1
Financiación:
Comisión Sectorial de Investigación Científica, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
A. ZEIDA (Responsable) , CHAVARRÍA, C. , RADI, R , AICARDO, A. , S Sastre , Mansilla, S. , A. Taboada , Sebastián F. Villar , Araújo, V. , S. Klinke
Palabras clave:
lactonasa
urolitinas
microbiota
biología estructural
Areas de conocimiento:
Ciencias Naturales y Exactas / Ciencias Biológicas /
Biofísica /
Ciencias Naturales y Exactas / Ciencias Biológicas /
Bioquímica y Biología Molecular /
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Funciones biológicas de conformaciones alternativas de citocromo c (03/2025 - a la fecha)
Código: FCE_1_2023_1_176133 El citocromo c es una proteína ubicada normalmente dentro de la mitocondria y participa en el proceso de respiración celular. Bajo ciertas condiciones, el citocromo c ejecuta otras funciones a nivel extra-mitocondrial, incluyendo la señalización de apoptosis. En la última década, hemos avanzado el concepto que a nivel celular y bajo la acción de interacciones físico-químicas, modificaciones oxidativas postraduccionales, o mutaciones se disparan en una fracción de citocromo c nativo cambios conformacionales a punto de partida de flexibilidad estructural pre-existente. Estas conformaciones alternativas del citocromo c difieren significativamente de la conformación nativa, tanto desde el punto de vista estructural, modificando el estado de coordinación del hemo, como cambiando posibles interacciones con otros blancos celulares y eventualmente participando en nuevas funciones no-canónicas. En particular, las conformaciones alternativas ganan actividad peroxidática y son traslocadas al núcleo celular sin promover apoptosis, por lo que es posible un rol como sensor y/o mediador redox intracelular. Recientemente, hemos reconstruido una herramienta fundamental para estudiar presencia y roles biológicos de conformaciones alternativas de citocromo c, el anticuerpo monoclonal R1D3. El objetivo general del proyecto es avanzar hacia la caracterización estructural, detección e identificación de nuevas funciones de conformaciones alternativas de citocromo c en sistemas in vitro, in cellula e in vivo de relevancia biomédica. La estrategia experimental comprende varias actividades que evalúan propiedades de proteoformas de citocromo c de conformaciones alternativas combinando 1) estudios estructurales in vitro por técnicas espectroscópicas de alta resolución, 2) análisis de respuestas transcriptómicas y proteómicas in cellula y 3) su detección y posible rol biológico en modelos de progresión tumoral in vivo. Los resultados obtenidos con las diferentes
aproximaciones estudiadas serán integrados y aportarán información crítica acerca de la generación, detección, resolución estructural y rol biológico de conformaciones alternativas de citocromo c de relevancia en fisiología y patología humanas.
3 horas semanales
Integrante del Equipo
En Marcha
RRHH formados en el proyecto:
Maestría/Magister:1
Doctorado:1
Equipo:
A. ZEIDA , RADI, R (Responsable) , PIACENZA, L (Responsable) , TOMASINA, FLORENCIA , LUCIANA HANNIBAL , M. Pose , SEBASTIÁN CARBALLAL , TÓRTORA, V. , DEMICHELI, V , JENNYFER MARTÍNEZ , CHIRIBAO, M.L
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Reducción de hidroperóxidos de ácidos grasos por peroxirredoxina 3 humana: estudios en enzima recombinante aislada y en un modelo celular. (03/2021 - 02/2024 )
Las peroxirredoxinas (Prxs), una familia de peroxidasas dependiente de tioles, juegan roles importantes en el sensado y transducción de señales derivadas de hidroperóxidos. La Prx3, exclusivamente mitocondrial, está involucrada en procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo participación en la homeostasis de glucosa y desarrollo de cáncer. La enzima reduce la mayor parte del peróxido de hidrógeno producido en mitocondria. Si bien se han relacionado disminuciones en la expresión de Prx3 con la oxidación de cardiolipina, fosfolípido abundante y de relevancia fisiopatológica presente en la membrana mitocondrial interna, se desconoce si la enzima es capaz de reducir hidroperóxidos de ácidos grasos (AG-OOH). En este proyecto nos planteamos investigar la actividad de la Prx3 en la reducción de AG-OOH, libres o formando parte de fosfolípidos. Para ello realizaremos experimentos con la enzima recombinante humana, así como en células
endoteliales, células sensibles a AG-OOH. En primera instancia haremos una caracterización de la cinética de las reacciones de oxidación y sobreoxidación del tiol peroxidático de Prx3 recombinante por AG-OOH libres o integrando fosfolípidos, mediante cinética de estado estacionario o de ciclo único por espectrometría de flujo detenido. También investigaremos la reactividad de la Prx3 unida a proteína fluorescente verde sensible a cambios redox (Prx3-rsGFP2), sonda fluorescente recientemente desarrollada por integrantes de nuestra propuesta, con estos hidroperóxidos lipídicos en comparación con otros hidroperóxidos, para validar su uso como sonda de dichos compuestos en tiempo real en células. Estudiaremos la afinidad de la Prx3 por AG-OOH por una combinación de técnicas de biofísica de proteínas y modelado molecular. Evaluaremos el efecto de la unión de la porción no reactiva de estos sustratos (AG) a la enzima sobre la reactividad con el grupo peroxilo. Por último, expondremos células endoteliales a dosis subletales de AG-OOH que se conoce ingresan a dichas células y se integran a sus fosfolípidos de membrana, así como a lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas. Investigaremos si dicha exposición conduce a la oxidación y sobreoxidación de Prx3 endógena, de Prx3-rsGFP2 y evaluaremos paralelamente las consecuencias en el potencial de membrana y funcionalidad mitocondrial, así como en la liberación de citocromo c hacia el citosol.
Consideramos que nuestros resultados permitirán una mejor comprensión del rol de la Prx3 en el sensado de AG-OOH a nivel celular. Asimismo, teniendo en cuenta el rol reportado para la enzima en procesos patológicos, nuestros resultados podrían facilitar futuros desarrollos terapéuticos.
5 horas semanales
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
Financiación:
Comisión Sectorial de Investigación Científica, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
A. ZEIDA , TRUJILLO, M. , ANÍBAL M. REYES , MANTA B , RADI, R , Hugo, M , Antonio Martinez Ruiz
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Metagenómica aplicada al descubrimiento de nuevas enzimas redox (03/2022 - 02/2024 )
Durante décadas el paradigma central de la biología redox fue que ciertos aminoácidos reactivos como son blanco de oxidantes y que los seres vivos poseen enzimas antioxidantes para reparar o proteger a las biomoléculas de ese ?daño oxidativo?. Sin embargo, hoy sabemos que varias enzimas ?antioxidantes? son en realidad traductores de señales que median entre oxidantes fisiológicos y moléculas efectoras, principalmente factores de transcripción. La mayoría de estas enzimas dependen de la química redox de la cisteína, la cual se oxida reversiblemente en el proceso de transferencia de información. A diferencia de lo que sucede con la cisteína, la oxidación reversible de metionina a sulfóxido de metionina (MetSO) ha recibido menos atención y su rol en biología está menos explorado. Varios organismos poseen metionina sulfóxido reductasas (MSR) que reparan el MetSO, lo que sugiere que ésta oxidación es biológicamente
relevante. Recientemente se descubrió una familia de enzimas (MICALs) con capacidad de oxidar metionina (actividad ?oxidasa de metionina?, MOX) y su descubrimiento auguraba una revolución en biología redox, ya que la existencia MOX y MSR sugería la existencia de ciclos de regulación centrados en la oxidación reversible de metionina, análogo al formado por quinasas y fosfatasas. Sin embargo, esta revolución no sucedió, en parte porque muy pocas MOX han sido descubiertas, y restringido a unos pocos organismos, y en parte porque las MSR no son tan ubicuas como originalmente considerábamos. Este proyecto se basa en la hipótesis de que existen nuevas MSR y MOX por descubrir, fundamentalmente en procariotas. Para descubrir estas enzimas proponemos combinar genómica comparativa, metagenomica funcional, ingeniería de genomas y bioquímica de proteínas para revelar, mediante selecciones genéticas y ?screening?, nuevas MRS y MOX. Esperamos que los resultados obtenidos en este proyecto permitan posicionar oxidación reversibles de metioninas como un eje central de la biología redox.
2 horas semanales
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
RRHH formados en el proyecto:
Maestría/Magister:1
Financiación:
Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
MANTA B , IRAOLA G. , A. ZEIDA , COMINI MA , Andrés Binolfi
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SARS-CoV-2 spike glycoprotein receptor binding domain (RBD) redox susceptibility (04/2021 - 04/2022 )
The project goal is to evaluate the spike glycoprotein RBD structural redox susceptibility at its four disulfide bonds in connection to binding properties to ACE2 and viral infectivity for SARS-CoV-2 major lineages (B, B.1, B.1.1.7, B.1.351, and P.1). With these studies we aim to a) establish a new research line in our laboratory connecting redox biology with viral infection processes, b) increase our understanding at the molecular level of the mechanisms of SARS-CoV-2 entry to human cells, c) assess structural changes in the spike protein RBD mediated by novel thiol-based compounds as a redox-based therapeutic strategy, d) foster a strong scientific collaboration with a leading US-based research group (Scripps Research, Florida).
10 horas semanales
Integrante del Equipo
Concluido
Financiación:
Richard Lounsbery Foundation, Estados Unidos, Apoyo financiero
Equipo:
RADI, R , A. ZEIDA , M. MACHADO , CORREA, A , K. Carroll , MORATORIO, G.
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Bases moleculares y celulares de la regulación del metabolismo oxidativo mediada por la aconitasa mitocondrial (ACO2). (03/2020 - 02/2022 )
La aconitasa mitocondrial (ACO2) es una enzima monomérica esencial del ciclo de los ácidos tricarboxílicos que cataliza la isomerización reversible del citrato a isocitrato. Si bien no es considerada una enzima reguladora del ciclo, su inhibición impacta en el flujo de metabolitos del ciclo, en la relación citrato/isocitrato, síntesis de ATP y formación de especies reactivas del oxígeno mitocondrial como ha mostrado nuestro y otros grupos. Contiene en su sitio activo un particular centro ferrosulfurado [4Fe?4S]2+ que no participa en reacciones redox y es altamente sensible a oxidantes biológicos. Cuando se oxida el centro FeS resulta en una enzima inactiva. Se han detectado modificaciones post-traduccionales (PTM) en aminoácidos de la proteína algunas oxidativas y otras relacionadas a cambios en metabolitos o señales celulares. La significancia estructural y funcional de estas modificaciones no ha sido totalmente dilucidada. Se ha postulado que la ACO2 interacciona con otras proteínas mitocondriales como la frataxina e incluso forma parte de los nucleoides al interaccionar con el ADNmt. Estas funciones han sido cuestionadas o poco estudiadas para ACO2 de mamífero. En este proyecto utilizado la ACO2 recombinante humana (hACO2), clonada y purificada por nosotros, buscamos dilucidar a nivel molecular cuáles son los cambios estructurales determinantes de las funciones de la ACO y cómo las PTM impactan en la estructura y función de la ACO2. Para ello se realizará una caracterización bioquímica/biofísica de la proteína in vitro, que será acompañada por simulaciones de dinámica molecular de la misma. Se realizarán estudios para dilucidar si hay interacción entre la hACO2 y la frataxina así como entre la ACO2 y el ADNmt. También planteamos identificar las PTM de la ACO2 en fibroblastos humanos senescentes, modelo que presenta aumento de la producción de ROS mitocondriales y dónde encontramos la ACO2 inhibida. Proponemos también modificar los niveles de expresión de la ACO2 en cultivos celulares para caracterizar los cambios metabólicos acontecidos. Los modelos celulares permitirán determinar además los distintos niveles de regulación que puede ejercer la ACO2, es decir cambios en la actividad por modificación del centro FeS, por PTM en los aminoácidos o en la expresión de la proteína.
2 horas semanales
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
RRHH formados en el proyecto:
Doctorado:1
Financiación:
Comisión Sectorial de Investigación Científica, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
CASTRO, L. ; Castro, L.A. , TÓRTORA, V. , Mansilla, S. , A. ZEIDA , INÉS MARMISOLLE , Javier Adrian DUTRA MOYA
Areas de conocimiento:
Ciencias Naturales y Exactas / Ciencias Biológicas /
Bioquímica y Biología Molecular /
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Susceptibilidad estructural al ambiente redox del dominio de unión al receptor (RBD) de la glicoproteína espicular de SARS-CoV-2 (07/2020 - 05/2021 )
Proyecto premiado por la Fundación Manuel Pérez, FMed, Udelar, en el marco del llamado "Fondos Especiales (COVID-19)"
El objetivo del proyecto fue evaluar la susceptibilidad estructural del dominio RBD de la glicoproteína espicular de SARS-CoV-2 al ambiente redox y su posible efecto en la interacción con ACE2. Para ello se propuso una combinación de técnicas experimentales y simulaciones computacionales que permitieran una caracterización de la importancia del estado redox de los cuatro disulfuros que presenta el RBD.
5 horas semanales
Investigación
Integrante del Equipo
Concluido
Financiación:
Facultad de Medicina, Uruguay, Apoyo financiero
Equipo:
RADI, R , M. MACHADO , A. ZEIDA , TRUJILLO, M. , CORREA, A , PORTELA, M.
Palabras clave:
SARS-CoV-2
prote?na Spike
disulfuros